好氧堆肥用枯草芽孢杆菌GX2产芽孢工艺优化（二）

2.1.2 碳源种类及其质量浓度的好氧优化

培养基是富含多种营养物质的混合物，碳源是堆肥组成培养基的主要成分之一，其主要作用是用枯芽孢优化构成菌体细胞成分并为生命活动提供所需能量，葡萄糖、草芽X产蔗糖、孢杆麦芽糖、工艺乳糖和可溶性淀粉均是好氧易被微生物利用的碳源。作者选择价廉易得的堆肥葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉为碳源，用枯芽孢优化进行碳源筛选及质量浓度优化，草芽X产结果如图2所示。孢杆

由图2(a)可知，工艺与对照不添加碳源相比，好氧添加蔗糖的堆肥细胞浓度略高，A_600nm达0.917，用枯芽孢优化而其他两种碳源的细胞浓度均低于对照，说明蔗糖有利于GX2的快速繁殖。其中，葡萄糖的4值显著低于对照，其可能是因为灭菌时会与其他物质反应生成抑制菌株生长的有毒物质，即“美拉德反应”产物。此外，随着蔗糖浓度的升高，细胞浓度先增加后降低(图2(b))，蔗糖添加量为5g/L时，细胞浓度最大，发酵液的A_600nm为1.175。故确定GX2的最佳碳源为蔗糖，添加质量浓度为5g/L。

2.1.3 氮源种类及其质量浓度优化

氮源主要用来构成微生物细胞和代谢产物的营养物质，常用的氮源有无机氮源和有机氮源。无机氮源成分单一，吸收利用较快；有机氮源含有丰富的蛋白质和游离的氨基酸，可以被生物缓慢利用。氮源种类及质量浓度优化结果如图3(a)和图3(1))所示。
 

2.1.4 装液量优化

溶解氧为好氧微生物生长所必需，是进行能量代谢的重要物质，供氧条件直接影响菌体生长繁殖以及细胞代谢。摇瓶培养的溶解氧浓度主要通过转速和装液量进行控制，相同搅拌转速条件下，装液量越大，溶解氧浓度越低，装液量直接影响菌体在生长过程。250mL摇瓶中装液量分别为50、100、150、200mL时，研究溶解氧对细胞浓度的影响，结果如图4所示。当装液量为100mL时，枯草芽孢杆菌GX2的细胞浓度最大，0D值达1.554，比未优化前提高了44.3％。

综上，好氧堆肥用芽孢杆菌GX2的摇瓶培养条件优化结果表明：GX2的最佳培养基为摇瓶基础培养基，5g/L蔗糖和5g/LNaN03，装液量为250mL摇瓶装液100mL。通过摇床培养基及培养条件优化，可有效提高枯草芽孢杆菌GX2的细胞浓度。

2.2 发酵罐分批补料技术研究

在实际的分批发酵过程中，连续或问隔补加限制性营养物质或新鲜培养基，称为分批补料发酵，可延长微生物的对数生长期和稳定期的持续时问，提高细胞浓度。分批发酵过程在细胞浓度不断增加进而耗尽可利用底物时，细胞浓度不再增加，而分批补料发酵可有效解决这一问题，提高发酵效率。

2.2.1 发酵罐分批补料对细胞浓度的影响

在摇瓶培养条件优化的基础上，以3L发酵罐进行扩大培养，当蔗糖质量浓度低于初始质量浓度的一半以下时，补加质量质量浓度50g/L的蔗糖溶液至初始质量浓度，研究发酵罐分批补料对枯草芽孢杆菌GX2细胞浓度的影响，结果如图5所示。

可见，与摇瓶培养不同，由于发酵罐可实现发酵条件特别是pH的在线实时控制，为枯草芽孢杆菌GX2提供了良好的生长环境，细胞繁殖速度加快，发酵至4h后即进入对数生长期，碳源(蔗糖)也快速被消耗，存第8小时时蔗糖质浓度由起始的5.0g/L左右降低至1.8g/L，成为制约菌体生长的关键因素，此时，补加50g/L的蔗糖溶液至4.5g/L左右，细胞浓度再次呈快速增长趋势，在第9小时时完成第二次补料，最终分批补料的发酵液最大A_600nm达2.250，而分批发酵的A_600nm为1.900，对应的活菌数分别为1.8×10¹⁰、1.2×10¹⁰CFU/mL，南此可见，分批补料操作可有效提高发酵液的营养细胞浓度。

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