胶体粒子与蛋白质相互作用及其应用（一）

食品的胶体及众多性质，如感官、粒蛋质感乃至其在体内的白质消化吸收，都和其结构紧密相关。相互该食品的作用结构的尺度从宏观开始，跨越介观，应用直到纳米尺度的胶体及微观。和其它测试结构的粒蛋技术相比，机械流变存在以下优点：测量设备相对简单，白质试验条件可控度高，相互能原位测试，作用测量结果是应用系统的平均行为，对应的胶体及基础理论成熟，因此，粒蛋机械流变是白质研究食品以及其它高分子体系相互作用及各种结构的重要手段。然而，食品中存在一类结构，如蛋白簇，它非常脆弱，很容易被外力破坏，这限制了该技术在食品中的应用。考虑到该类结构在食品中广泛存在，如酸奶、溶液乳化过程等，因此催生一种新的流变学技术--微流变技术（Microrheology）。除了继承机械流变的优点外，该技术还有用量少，速度快，可重复性高，没有外加力对食品部分弱结构造成影响，测量频率范围广等优点。

微流变技术是通过测量小颗粒（直径约1μm）在所测量体系中的布朗运动，通过广义Stokes-Einstein关系式，来估算体系的流变学的相关参数。这些小颗粒被命名为示踪粒子，常见的示踪粒子既可以是体系本身所含的颗粒，也可以是高分子胶体粒子。由于颗粒大小能显著影响微流变技术所得结果，结构清晰的高分子胶体颗粒受到了研究者的青睐。由于微流变测量中，颗粒的布朗运动为热量所驱动，示踪粒子在体系中运动时，除了受到周围环境纯流体力学的拖曳力外，应不存在其它相互作用影响粒子运动。示踪粒子的尺度应小于体系中网格（如存在的话）的尺寸，同时示踪粒子可以用硬球模型来表示，即示踪粒子和体系中其它成分不存在相互作用。

随着微流变技术的普及，一些食品科学工作者开始使用该技术。有些使用者在应用的过程中对上述的要求不清晰，特别是容易忽略胶体粒子的表面性质以及与蛋白质分子之间的相互作用，使获得的微流变信息与真实值具有一定差距。解决这一问题的关键是将体系中添加的粒子与蛋白之间的相互作用进行建模，选择一个合适、简单且有效的模型研究体系的微流变行为。

在研究过程中，溶液体系的黏度是影响测量结果的一个重要指标。然而，研究者往往会忽略黏度的校正，造成测量结果偏离真实值。黏度法是检测蛋白分子构象及溶液性质的最基本的方法之一。目前国内利用微观流变学研究蛋白溶液黏度的报道不多。本文将不同的蛋白质与不同的胶体粒子之间的相互作用作为切入点，利用动态光散射技术建立一种有效的微观测量溶液体系黏度的方法，为复杂食品体系的微流变研究提供理论依据，为食品加工过程中蛋白质的开发和利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

三羟甲基氨基甲烷（Tris），购于国药集团化学试剂有限公司；聚苯乙烯微球（A）与聚苯乙烯-羧基微球（B），购于苏州智微纳米科技有限公司；聚苯乙烯微球（C）、牛血清蛋白（BSA）（Lot#WXBC5159V）、溶菌酶（lys）（Lot#SLBJ4107V）、β-乳球蛋白（BLG）（Lot#SLBS6536）、卵白蛋白OVA（Lot#SLBQ9036V）等，均购于Sigma公司。

1.2 样品制备

配制1000mL，20mmol/L，pH=7.4Tris-HCl缓冲液，放入4℃冰箱备用。准确称取0.4g的BSA、BLG、lysozyme3种蛋白质，用Tris-HCl缓冲液分别溶解。使最终蛋白质量浓度为20mg/mL。称取0.1gOVA，用Tris-HCl缓冲液溶解，使最终蛋白质量浓度为10mg/mL。为了使蛋白原始溶液充分水化溶解，将配好的4种蛋白溶液分别放置在磁力搅拌器中搅拌2h，搅拌速度为150r/min，之后将溶液放置于4℃冰箱保存24h。将放置24h后的4种蛋白原始溶液用Tris-HCl稀释2～10倍5个浓度梯度至10mL，备用。

1.3 动态光散射（DLS）测定

动态光散射技术通过Stokes-Einstein方程变形得到方程（1），通过测量体系中球形颗粒的平移扩散系数来计算颗粒粒径和液体黏度。

式中：η—溶剂的黏度，mPa·s；κ_B—波尔茨曼常数，J/K；T—温度，K；R—水力学半径，nm；D—扩散系数，cm²/s。

分散的胶体粒子在液体中做无规则布朗运动时，在固定散射角θ处观测到的散射光光强Ι（t）随时间涨落，相关时间的指数衰减函数如下：

G（τ）=[Ι（t）·Ι（t+τ）]        （2）

方程（2）中：Ι（t）—散射光光强；τ—衰减时间，ms。衰减时间τ与表征体系中粒子的集体布朗运动平移扩散系数D有如下关系：

式中：q—散射矢量，cm^-1；n—样品折射率；λ₀—光在真空中的波长，nm；θ—散射角，°。将（3）式带入（1）式得到最终黏度计算公式为：

式中：η—溶剂的黏度，mPa·s；κ_B—波尔茨曼常数，J/K；T—温度，K；τ——衰减时间，ms；R—水力学半径，nm。

分别取2.5mLTris-HCl缓冲液，快速经过0.22μm的滤膜（水膜）过滤后，缓慢滴入3个已经由丙酮淋洗干净的光散射专用测量瓶中，用移液枪取2μL3种不同胶体粒子分别加入Tris-HCl缓冲液中，轻轻摇匀使胶体粒子充分分散在体系中避免气泡给试验带来干扰，等待测量。

2.5mL稀释好的不同浓度梯度的蛋白溶液，快速经过0.22μm的亲水滤膜，放入已经由丙酮淋洗干净的光散射专用测量瓶中。重复3次，在相同浓度蛋白溶液测试样品中，分别用移液枪精确滴入2μL3种胶体粒子（A，B，C），轻轻摇晃光散射瓶子30s，使胶体粒子充分分散在溶液中。所测量的每种蛋白有15个样品，所有样品均操作相同，清楚标记每个样品名称。

本试验选择的测量波长为632.8nm，测量角度为90°，测量温度为25℃，测量时间为30s，每个样品重复测量10次。

1.4 胶体粒子zata电位测定

取3个试管，分别加入3mLTris-HCl缓冲液，用移液枪取2μL3种不同胶体粒子分别加入到3个试管溶液中摇晃，使胶体粒子充分分散到溶液中，取样加入到样品池中25℃等待测量。样品测试前在仪器中平衡60s，设定蛋白模式程序，每组运行11次，运行3组，结果为多次测试的平均值。

1.5 均方旋转半径Rg的测定

在25℃下，将动态光散射所制备的样品放入样品瓶，利用光散射仪对BSA，BLG，lys3种蛋白与3种粒子做静态光散射分析。测试角度范围为30°～60°，2°为一个梯度，测试误差为5%，测试时间为30s，测试中入射光强保持不变，待测样品平行测定3次。

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