酶法制备壳寡糖及其抗肿瘤活性评价（一）

壳聚糖是酶法一种海洋来源的相对分子质量小于3000的低聚糖。目前，制备肿瘤壳寡糖大都通过化学法(包括酸解法和氧化法)、壳寡物理法以及酶解法(纤维素酶吲或壳聚糖酶)降解得到。糖及基于壳聚糖酶的其抗专一性与高效性，用其制备壳寡糖的活性方法具有良好的应用优势和发展潜力。

COS相对分子质量低的酶法特性不但改善了其原料水溶性差的问题.同时其也具有广泛的生物功能，包括抗炎、制备肿瘤抗菌闭、壳寡抗氧化、糖及降糖同及神经保护等。其抗近年来，活性针对COS抗肿瘤活性的酶法研究逐渐成为热点。

研究表明，制备肿瘤在多株肿瘤细胞(胃癌细胞、壳寡肾癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞等)中，COS均能达到半数致死的效果。相对分子质量和去乙酰度影响其抗肿瘤活性，且低相对分子质量表现出更为明显的效果。在作用机制探索方面，COS可通过诱导HeLa和A549细胞的自噬性死产而抑制细胞增殖，对A549细胞，COS还可明显降低细胞线粒体膜电位水平而促进细胞凋亡。此外，COS可通过上调p21，下调PCNA、cyclinA和cdk-2基因抑制HepG2细胞的DNA合成速率，抑制细胞增殖；通过诱导SW480细胞阻滞在G2/M期而抑制细胞增殖。由此可见，COS对不同肿瘤细胞的作用和机制并不完全相同，其对肿瘤细胞的作用还有待进一步研究。

为了进一步了解COS潜在的抗肿瘤作用，首先以壳聚糖酶酶解法自行制备COS，建立基于分级处理的COS优化制备工艺，将获得的低相对分子质量COS产物对不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性进行评价初筛，进而在作用最为显著的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中进行量效关系评价及初步机制探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖酶：由作者所在实验室白行构建的重组菌EcoliRosetta-gami(DE3)/ChiE发酵产酶，经纯化浓缩后得到壳聚糖酶酶液，酶活为2260U/mL；COS、氨基葡萄糖、无水乙醇、亚硫酸氢钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、冰醋酸、Tris：购自国药集团上海化学试剂公司：盐酸阿霉素：购于上海麦克林生化科技有限公司：DMEM、RPMI1640基础培养基、FBS胎牛血清、抗生素、胰酶、Dulbecc0’sPhosphateBufferedSaline(DPBS)：购于美国Gibco公司；纳滤膜：购于美国陶氏化学公司；Transwell小室、CellCountingKit-8(CCK-8)试齐0盒：购于美国ThermoFisher公司。
质量分数1％的胶体COS溶液：取1gCOS粉末加入少量去离子水溶胀，加入30mL的0.4mol/L的乙酸溶液搅拌至COS粉末完全溶解，再以2mol/L的NaOH调节pH至6.0，加水定容至100mL。

DNS试剂：准确称取244.4g酒石酸钾钠加到500mL煮沸的蒸馏水中溶解，然后依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g、NaOH21g、苯酚5g和亚硫酸氢钠5g，搅拌至溶解后定容至1L，棕色瓶中贮存，一周后可使用。

1.2 仪器与设备

pH计：上海Mettler-Toledo公司产品；紫外分光光度计：上海尤尼可仪器有限公司产品：数显恒温水浴锅：金坛区富华电器有限公司产品；高速冷冻离心机：日本日立公司产品；超高效液相色谱串联四极杆飞行时问质谱联用仪：美国沃特世公司产品；酶标仪：上海精密科学仪器有限公司产品；细胞培养箱：美国ThermoFisher公司产品；全自动倒置荧光显微镜(共聚焦超分辨成像系统)：日本Nikon公司产品。

1.3 方法

1.3.1 COS的酶法制备

探究酶解时间对酶解效果的影响时，反应体系包含制得的质量分数1％COS溶液10mL(乙酸钠缓冲液，pH6.0)和0.3mL酶液，50℃下酶解8h，间隔1h取样测定还原糖含量。

探究加酶量对酶解效果的影响时，向质量分数1％的COS溶液中分别加入壳聚糖酶60、90、120、150、180U/g。体系在50℃下酶解4h，反应结束后测定还原糖含量。

1.3.2 DNS法测定还原糖质量浓度

以氨基葡萄糖为标样，制作标准曲线：准确称取10mg氨基葡萄糖，溶解定容至100mL，再分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，以去离子水补至1mL，各加入1niLDNS，沸水浴5min，冷却定容至5mL，于540nm处测定吸光度。空白组为同样步骤下1mL去离子水。

分别取1mL酶解产物，加入1mLDNS溶液，沸水浴中反应5min，迅速冷却至室温，在540nm处测量吸光度。去离子水作为空白对照。

1.3.3 COS的制备工艺

最适酶解条件下得到的壳寡糖酶解液，经100℃水浴15min后10000r/min离心除酶。上清液加入体积分数70％乙醇后4℃过夜。离心收集的上清液依次经截留相对分子质量3000的膜超滤留取滤过液，经截留相对分子质量300的膜纳滤收取截留液后，浓缩并冻干得到COS样品。

1.3.4 液相色谱-质谱联用测定COS样品成分

液相色谱条件：色谱仪WatersaequityUPLC,检测器WatersaequityPDA，柱温45℃，流量0.3mL/min，进样量10μL。质谱条件：电喷雾电离(ESI+)，离子源温度100℃，脱溶剂气温度400℃，扫描范围m/z20-2000。

1.3.5 细胞培养

HepG2细胞和PATU-8988细胞培养在含体积分数90％RPMll640基础培养基、体积分数10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/L链霉素的培养基内；MDA-MB-231细胞基础培养基为DMEM，其他条件同上。于37℃、体积分数5％CO2的细胞培养箱中贴壁培养，每3d传一代。

1.3.6 CCK-8法测定细胞生存率

取汇合度90％的细胞，5×10³个/mL的细胞浓度铺板至96孔板。考察1～1000μg/mL质量浓度范围内COS对3株肿瘤细胞作用24h的生存率影响。COS与阿霉素(DOX)复合给药时，首先确定DOX质量浓度为细胞生存率为50％所对应的质量浓度(IC₅₀)，即2.5μg/mL。以质量浓度为1、10、100、1000μg/mL的COS作用6h后给药DOX孵育24h。之后每孔加10μLCCK-8，孵育1.5h后测A_450nmo阳性对照组为DOX，空白组为培养基，计算细胞生存率，公式如下：

式中：V为细胞生存率，％；A_P为药物组在450nm处吸光度；A_B为空白组存450nm处吸光度；A_C为对照组在450nm处吸光度。

1.3.7 细胞迁移实验

汇合度90％的MDA-MB-231细胞消化后，以饥饿培养基重悬，以每孔1×10⁵个接种于24孔板的小室内。细胞完全贴壁后加入500μg/mLCOS培养24h，吸去培养基。多聚甲醛固定30min，DPBS洗3遍，结晶紫染色30min。用流水冲至孔板无色，将小室取出，擦净内部底面后倒置拍照。之后将小室放入24孔板中，每孔加1mL体积分数33％冰醋酸，振荡，取200μL液体测A_570nm。

1.3.8 激光共聚焦检测细胞对DOX的摄取

将对数生长期的MDA-MB-231细胞以1×10⁴个/mL的细胞浓度铺板至激光共聚焦专用培养皿。联用组加入500μg/mLCOS1mL，作用4h后再加入1mL含有2倍终质量浓度DOX培养基，对照组为DOX单独给药组。培养箱中继续孵育1、3、5h。吸去培养基，DPBS洗1遍，经多聚甲醛同定和DAPI染色各20min后，DPBS洗3遍。包裹锡箔纸，避光拍照。

1.3.9 统计学分析

数据采用平均值±标准差表示。单因素数据采用单向方差分析法分析。显著性差异表示为*4P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。用GraphPadPrism软件制图分析。

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