一株生防烟管菌几丁质酶表达及抗真菌活性（一）

1引言

植物真菌病害是株生造成农产品损耗的主要原因之一，在实际生产中造成了不可估量的防烟经济损失。病原菌侵染植株后，管菌使农作物局部或整株感病，丁质达及影响作物生长，酶表严重时造成植株死亡，菌活导致农产品产量降低，株生品质下降。防烟多数病原菌不仅能在作物生长过程中影响植株状态，管菌还在农产品的丁质达及运输过程中造成产品腐烂变质，是酶表造成果蔬运输损耗的主要原因。此外，菌活部分真菌病原菌能够分泌真菌毒素，株生食用含有真菌毒素的防烟果蔬能够导致畸胎或诱发癌症，威胁人类健康。管菌如多种链格孢产生的链格孢毒素以及多种曲霉产生的伏马霉素B。

几丁质，是由N-乙酰基-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）单体通过β-1，4-糖苷键连接的聚合物，也是病原真菌细胞壁的主要成分。在丝状真菌中，几丁质和其他葡聚糖含量占细胞壁成分的70%以上，在部分酵母中，几丁质含量甚至达到细胞干重的10%～20%。几丁质酶可以通过外切和/或内切水解酶作用将几丁质裂解为GlcNAc或GlcNAc的可溶性寡聚体。因此，以几丁质作为分子靶标，通过几丁质酶的水解作用来实现植物病害防治是植物病害控制的有效途径。而生物防治因子分泌细胞壁裂解酶，裂解病原真菌细胞壁，也成为生物防治微生物拮抗植物病原真菌的主要机制之一。

烟管菌（Bjerkanderaadusta）属于非褶菌目，多孔菌科，烟管菌属。目前，对于烟管菌（Bjerkanderaadusta）的研究主要集中在环境科学领域，但仍不乏烟管菌对植物真菌病害治理的研究报道。1982年，Dománski发现烟管菌能够抑制栎树（Quercusrobur）褐腐病的发生。2011年，Bak等研究发现了烟管菌对欧美黑杨（Populuseuramericana）干腐病具有防控能力；2015年，汪华等人筛选出一株对水稻纹枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科罗尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）等引起的植物病害具有很好防治效果的烟管菌M-1；2017年，Zhang等人研究发现烟管菌能够有效的抑制西瓜蔓枯病菌（Didymellabryoniae），并在2018年首次探究了烟管菌对核盘菌的抑制作用及其对油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum）的防治效果。但目前，仍然缺乏烟管菌生物防治机制研究。本研究结合抗病效果和RT-qPCR分析，首次从烟管菌中筛选并克隆出一个几丁质酶基因，并通过外源表达证明了该酶的抗真菌活性。推测该基因是烟管菌发挥生防作用过程中的细胞壁裂解酶基因。

2材料与方法

2.1材料

本氏烟（Nicotianabenthamiana）。

烟管菌（Bjerkanderaadusta）菌株BK-1从四川省马尔康市土壤中获得，保藏于本实验室，ITS序列号为MW182414（NCBI）。链格孢（Alternariaalternata）菌株CD-1，链格孢苹果专化型（Alternariaalternataf.sp.mali）L-1，细极链格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰葡萄孢（Botrytiscinerea）DY-1均为本实验室保藏菌种。尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄链格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）购自北纳生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物见表1及表2。

2.2方法

2.2.1烟管菌抗病能力分析

将灰葡萄孢，链格孢和细极链格孢转接到PDA培养基中25℃活化培养7d，使用直径为5mm的打孔器切取菌丝琼脂块作为接种物；烟管菌活化培养7d后，将5个直径为5mm的烟管菌菌丝琼脂块接种至液体的100mLPDB培养基中25℃，180r/min活化培养7d后使用粉碎机打碎，制成烟管菌菌丝悬液作为抗菌液（AntiL）备用。

离体实验：从生长30d的烟草植株上剪取健康的烟草叶片流水冲洗10min，使用保鲜膜封住叶柄切口处，放置于无菌水浸湿的三层滤纸上，在主叶脉两侧对称位置分别涂抹50μL无菌水和烟管菌菌丝悬液后接种病原菌菌丝琼脂块作为对照组和实验组，每组6重复。再将叶片和滤纸放入上层开口的塑料盒中，上层使用保鲜膜封口保持盒内湿润。将其置于温室内（23℃，16h光照；18℃，8h黑暗），保持48h（细极链格孢侵染96h）后对烟草叶片进行拍照记录。

活体实验：选取健康的烟草植株，将从上至下第4片叶片作为接种对象，接种方法同离体实验。将接种后的植株放置在密闭，透光且湿润的育苗盆内，温室培养48h（细极链格孢侵染96h）后拍照记录。

上述实验至少重复两次，并使用ImageJ进行叶片感病面积统计。

2.2.2生物信息学分析

参考该菌株基因组相关信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），使用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对其几丁质酶基因和β-1，3-糖苷酶基因进行信号肽预测；并在NCBI数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对几丁质酶的保守结构域进行比对。

2.2.3对峙培养及RT-qPCR分析

将6种病原真菌和烟管菌接种到PDA培养基中，25℃避光条件下活化培养5d，使用打孔器取各菌落边缘处直径为5mm的菌块。分别将烟管菌和一种病原菌接种到新的PDA培养基中，各距离平板边缘2cm，并使两菌块保持在同一直径线上25℃避光培养。

使用真菌RNA快速抽提试剂盒（生工），提取对峙培养实验中接种后第6d相互接触区域菌丝的RNA，使用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）进行反转录获取cDNA.以cDNA为模板，以18SrRNA作为参考基因，使用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）试剂盒（擎科）对预测具有信号肽结构的几丁质酶基因和β-1，3-糖苷酶基因进行表达量测定。

2.2.4烟管菌几丁质酶基因BaCHIB克隆

使用高保真酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）扩增去除信号肽区段的几丁质酶基因BaCHIB-T，并在C端添加6×His蛋白纯化标签。以烟管菌cDNA为初始模板，后续PCR过程依次使用上一步扩增产物为模板，得到目的片段BaCHIB-T，具体引物如下：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

使用限制性内切酶EcoRⅠ和NotI处理载体pPIC9K.利用同源重组试剂盒（诺唯赞）将BaCHIB-T与线性化的载体同源重组得到重组载体pPIC9K-BaCHIB-T（图1），测序正确的表达载体使用限制性内切酶salⅠ线性化，醋酸锂转化法转化毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌株。

2.2.5重组蛋白的表达和纯化及抗真菌活性

蛋白的表达和纯化按照Deng等的方法进行，并进行改进。重组载体的表达菌株经0.5%的甲醇诱导5d，相同处理的空载转化菌株用于对照组。依次使用含有80，100，120，140mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液（PBS）洗脱与柱结合的目标蛋白。目的条带经SDS-PAGE电泳检测。几丁质酶活性测定使用几丁质酶活性检测试剂盒（索莱宝）。

纯化后的重组蛋白，浓度调整为200μg/mL进行抗真菌活性检测。从活化5d的链格孢，茄链格孢和灰葡萄孢的平板边缘切取两块边长约为5～10mm的正方形菌丝琼脂块，并将其置于2mL离心管中。每管加入400μL纯化蛋白溶液作为实验组，等量蛋白洗脱液作为对照组25℃暗培养48h后，观察菌丝生长状况。

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