响应面法优化绿豆抗氧化肽的制备工艺（二）

（2）绿豆多肽抗氧化性与酶浓度的面法关系

参照于慧等人的方法进行DPPH自由基清除率的测定。将2mL一定浓度的优化艺绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，绿豆取出后于517nm波长下进行吸光值的抗氧测定，此时吸光度值记录为A_i；将上述过程中的化肽2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，然后与2mL绿豆多肽溶液进行反应，备工此条件下测定吸光值记录为A_j，面法将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反应的优化艺条件作为空白组，此时记录吸光值为Ao。绿豆结果如图2所示。抗氧

由图2可知，化肽当酶浓度低于6％时，备工DPPH清除率随着酶浓度的面法增加而增大，当酶浓度超过6％时，优化艺DPPH清除率随着酶浓度的绿豆升高而降低。整体呈现先上升后下降的原因在于随着酶浓度的升高，有效酶浓度逐渐加大。当底物的浓度维持不变，有效酶浓度逐渐增多，从而起到抑制作用，使酶水解的不彻底，故水解得到的抗氧化肽减少，进而导致DPPH清除率降低。

（3）绿豆多肽抗氧化性与pH的关系

本实验在于研究酶法对绿豆蛋白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，选择酶解时间、酶解温度、酶添加量以及pH为因素进行单因素实验。改变反应pH，结果见3所示。
 

由上图可知，当pH在7.0～9.0时，DPPH的清除率随着pH的增大逐渐增大，当pH为9.00时，DPPH清除率达到最大值，为43.89％。当pH超过9.0时，DPPH清除率逐渐减小。这是因为蛋白酶只有在一定的pH区间内具有较高的活性，当蛋白酶处于过酸或过碱的条件下时蛋白酶的结构会被破坏，导致部分蛋白无法完全水解，疏水基团未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

（4）绿豆多肽抗氧化性与酶解时间的关系

通过单因素实验的结果，可以筛选出各因素的三个水平。所以在此基础之上，应用统计分析软件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，进行回应面优化设计。改变酶解时间结果见4所示。

二、结果与讨论

1、单因素实验结果

（1）绿豆多肽抗氧化性与酶解温度的关系

将绿豆蛋白配置成一定浓度的溶液，水浴加热至100℃进行15min均质处理。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。结果如图l所示。

由图1可知，当酶解温度低于50℃，DPPH清除率与温度成正比，当温度超过50℃时，DPPH清除率开始下降。这是因为蛋白酶对稳定的要求较高，温度过低会影响酶解的反应速度，使酶解反应不彻底，从而影响抗氧化肽的抗氧化效果。而温度过高则会影响蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，无法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，从而使DPPH清除率降低。

（2）绿豆多肽抗氧化性与酶浓度的关系

将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为A_i；将上述过程中的2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，然后与2mL绿豆多肽溶液进行反应，此条件下测定吸光值记录为A_j，将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反应的条件作为空白组，此时记录吸光值为Ao。结果如图2所示。

由图2可知，当酶浓度低于6％时，DPPH清除率随着酶浓度的增加而增大，当酶浓度超过6％时，DPPH清除率随着酶浓度的升高而降低。整体呈现先上升后下降的原因在于随着酶浓度的升高，有效酶浓度逐渐加大。当底物的浓度维持不变，有效酶浓度逐渐增多，从而起到抑制作用，使酶水解的不彻底，故水解得到的抗氧化肽减少，进而导致DPPH清除率降低。

（3）绿豆多肽抗氧化性与pH的关系

本实验在于研究酶法对绿豆蛋白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，选择酶解时间、酶解温度、酶添加量以及pH为因素进行单因素实验。

实验条件进行实验，改变反应pH，结果见3所示。

由上图可知，当pH在7.0～9.0时，DPPH的清除率随着pH的增大逐渐增大，当pH为9.00时，DPPH清除率达到最大值，为43.89％。当pH超过9.0时，DPPH清除率逐渐减小。这是因为蛋白酶只有在一定的pH区间内具有较高的活性，当蛋白酶处于过酸或过碱的条件下时蛋白酶的结构会被破坏，导致部分蛋白无法完全水解，疏水基团未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

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