蒙药砂蓝刺头定性与定量质量控制方法研究(二)
2.3.2 色谱条件 以Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,蒙药5μm)为色谱柱;乙腈(A)-0.1%甲酸(B)为流动相梯度洗脱(0~7 min,5%A;7~35 min,5%~28%A;35~53 min,28%~90%A;53~65min,90%A);体积流量1.0 m L/min;柱温30℃;检测波长为275 nm;进样量为10μL。 2.3.3 精密度试验 称取样品粉末0.25 g(S5),砂蓝按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液,定性定量按“2.3.2”项下色谱条件连续进样6次,质量以MMQ(S)峰为参照峰,控制计算色谱图中特征峰相对保留时间和相对峰面积,研究结果显示RSD分别为0.05%~0.49%和0.39%~2.15%。蒙药 2.3.4 稳定性试验 取同批次砂蓝刺头粉末(S5)1份,砂蓝按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液,定性定量按“2.3.2”项下色谱条件分别于0、质量1、控制2、研究4、蒙药6、砂蓝12、定性定量24 h进样,以MMQ峰为参照峰,记录和计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积。结果显示RSD分别为0.06%~0.54%和0.33%~1.89%。 2.3.5 重复性试验 取同一批次砂蓝刺头粉末(S5)6份,按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.2”项下色谱条件进样,以MMQ为参照峰,记录和计算各共有峰保留时间、相对峰面积,计算其RSD分别为0.07%~1.11%和0.32%~3.19%。 2.3.6指纹图谱的建立与分析 按“2.3.1”项和“2.3.2”项对样品进行制备和测定,记录色谱图。运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004版)”,导入S1~S9号样品HPLC数据,以S1为参照图谱,选择平均数法进行自动峰匹配,生成EGT对照指纹图谱(图2-A)。以EGT对照指纹图谱为参照图谱,同时导入7批(S10~S16)蓝刺头属其他种样品HPLC图谱数据,选择平均数法进行自动峰匹配,得到蓝刺头属其他种图谱(图2-B)并计算相似度。 计算得到S1~S9号样品相似度分别为0.970、0.950、0.922、0.989、0.959、0.978、0.980、0.916、0.697,伪品相似度分别为0.849、0.452、0.806、0.327、0.499、0.580、0.832。除批号为20120815样品外,其余EGT样品相似度均在0.9以上,种内相似度较高,而蓝刺头属其他种植物样品相似度均低于0.9。 将S1~S9号样品与蓝刺头属其他种样品的指纹图谱进行比较,并结合各色谱峰的峰形、峰高以及分离情况等信息,标定了8个特征峰,并经对照品指认4个峰,分别为2号峰是水杨酸、4号峰是绿原酸、5号峰是MMQ、6号峰是异绿原酸,其中MMQ是本研究发现的含量较高的专属性成分,其色谱峰的对称性好、峰较高,与相邻色谱峰达到基线分离,故选定MMQ为参照峰(S)。并计算得到各特征峰相对保留时间的RSD均小于3%,表明特征峰的出峰时间较为稳定,但其相对峰面积的RSD相差较大,表明不同批次中各成分含量存在一定的差异。将16批样品指纹数据进行初步数据筛选,筛选出峰面积比>2%的指纹数据,结果导入SIMCA 13.0软件,进行最小二乘法判别分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)与聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA),结果见图3和图4。从OPLS-DA和HCA结果显示,EGT与蓝刺头属其他种样品分成2大类,说明所建立的EGT特征指纹图谱有一定的鉴别作用,可用于EGT的质量评价。 VIP结果显示13号峰(MMQ)为最主要的贡献成分,该成分为EGT的专属性成分,可作为EGT含量测定的指标成分。 2.4 MMQ的定量测定 2.4.1 色谱条件 采用Diamonsil Plus C18(250mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;乙腈-0.1%甲酸水溶液(14∶86)为流动相,体积流量为1.0 m L/min,柱温30℃,检测波长为230 nm,进样量为10μL。理论板数按MMQ峰计不低于2500。对照品溶液和供试品溶液的HPLC见图5。 2.4.2 供试品溶液的制备 取EGT样品(过3号筛)0.25 g,精密称定,置100 m L具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 m L,称定质量,超声(功率250 W、频率40 k Hz)处理30 min,放冷,用70%甲醇补充减失质量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。 2.4.3对照品溶液的制备 精密称取MMQ对照品10.12 mg,置于10 m L量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成含1.012 mg/m L MMQ的溶液,作为对照品贮备溶液。 声明:本文所用图片、文字来源《中草药》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系删除 相关链接:色谱,甲醇,对照品
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