保加利亚乳杆菌的筛选及其发酵乳中的风味物质（一）

乳酸菌是保加指发酵乳糖主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的利亚总称。其广泛分布于自然界中，乳杆乳中一般主要存在于人体、菌的及动物体及各种发酵食品中。筛选1905年，发酵Grigoroff首次从酸奶中分离出保加利亚乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）。味物该菌株是保加酸奶发酵剂中重要的菌种之一，具有清肠、利亚整肠、乳杆乳中提高机体免疫力、菌的及抗癌及抗肿瘤等重要的筛选生物学功能。

Kataoka等研发出一种样品前处理技术-固相微萃取（Solid-phasemicroextraction，发酵SPME）。味物SPME技术具有操作简单、保加成本低、灵敏度高等优点，广泛应用在风味检测的各个领域。武士美等采用SPME-GC/MS技术对保加利亚乳杆菌发酵乳中的挥发性风味物质进行分析，鉴定了乙酸、乙醛、双乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯等多种风味化合物，并筛选出具有优良风味的菌株。Bao等采用该技术分析干酪乳杆菌（Lactobacillscasei）发酵乳中的挥发性化合物，检测出的主要风味化合物有乙酸、丁酸、双乙酰和己酸乙酯等。任为一等采用该技术分析发酵乳中的风味物质，发现双乙酰、乙偶姻、乙醛、2-壬酮等化合物对发酵乳风味贡献较大。

酸奶是一种受消费者喜爱的传统发酵乳制品，然而，关于保加利亚乳杆菌在牛乳发酵过程中产生的风味及其发酵特性的报道较少。本研究以来自蒙古国和西藏传统发酵乳制品中的7株保加利亚乳杆菌为研究对象，系统考察贮藏12h时发酵乳中风味物质的多样性，并测定发酵和贮藏12h时的pH值、滴定酸度（ＴA）、活菌数和黏度，旨在为传统酸奶发酵剂的基础研究提供参考。

1材料与方法

1.1菌株与试剂

内标（InternalStandard，ISＴD）1，2-二氯苯，Sigma公司；全脂奶粉，美国Fonterra公司；MRS液体培养基（MRSBROＴH），英国Oxoid公司。试验菌株：7株保加利亚乳杆菌由实验室提供。菌株详细信息见表1。

1.2试验方法

1.2.1样品制备

将真空冷冻干燥保藏的保加利亚乳杆菌接种于MRS液体培养基中，连续传3代，使菌株活力达最大。在50mL和200mLMRS液体培养基中扩大培养，离心收集菌体，将菌体重悬于无菌PBS保护剂中制备菌悬液。取适量蒸馏水加热至50℃，加入11.5%全脂乳粉搅拌溶解，当水温升至60℃时加入6.5%蔗糖，水合30min，且温度始终保持在60℃，连续均质2次（65℃，15MPa和35MPa），得到的均质乳在95℃处理5min后快速冷却至42℃。将制备好的菌悬液以5×10⁷CFU/mL的量接种到均质化的全脂乳中，分装至样品瓶，并在42℃发酵。待样品的pH值达到发酵终点4.5，ＴA在70～90°Ｔ时，将样品移至4℃贮藏12h，待测。

1.2.2发酵乳的理化特性

1.2.2.1pH值和滴定酸度的测定

发酵乳样品用雷磁PHS-3C型pH计测量，调整温度在20～22℃范围，平行测量发酵乳的pH值。使用电子天平精确称量5g发酵乳样品，置于100mL锥形瓶中，向锥形瓶中加入40mL蒸馏水和3滴酚酞指示剂，充分摇动。加入0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至出现微红色且30s内不退色。记录加入的NaOH标准溶液体积。每个发酵乳样品测定3个平行。计算滴定酸度（ＴA）的公式（1）如下：

式中：X—发酵乳样品的酸度，°Ｔ；c—NaOH标准溶液浓度，mol/L；v—滴定时消耗的NaOH标准溶液体积，mL；m—发酵乳样品的质量，g；0.1—酸度理论定义NaOH溶液的浓度，mol/L。

1.2.2.2黏度的测定

取40g发酵乳样品，用黏度仪的4#转子测定其黏度，转子转速100r/min，扭矩20%～100%，测定时间30s，每个样品测定3个平行，取平均值。

1.2.2.3乳酸菌活菌

计数采用稀释平皿倾注法检测保加利亚乳杆菌发酵乳中活菌数的变化。用0.85%无菌NaCl对样品进行10倍梯度稀释，分别取10^-5，10^-6，10^-7的稀释液各1mL于无菌培养皿上，37℃厌氧培养48h。

1.2.3挥发性风味物质的测定

使用Agilent7890B气相色谱仪和5977A质谱仪测定发酵乳中的挥发性风味化合物。将萃取头（50/30μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）在Agilent7890B气相色谱仪进样口（250℃）老化5min，插入气相瓶上方，萃取样品中的风味化合物。萃取条件：温度50℃，磁力搅拌器转速300r/min，萃取时间60min。柱温：采用程序升温，初始温度35℃，保持5min；以5℃/min升至140℃，保持2min后以10℃/min速率升至250℃。试验用载气为高纯氦气，载气流速1.0mL/min，不分流进样。汽化室温度250℃。电离方式EI离子源，电子能量70eＶ，离子源温度230℃，质量扫描范围m/z35～500，发射电流100μA，检测电压1.4kＶ，无溶剂延迟。

1.2.4定性与定量分析

利用随机携带Masshunter工作站NISＴ11标准库自动检索各组分质谱结果，根据保留时间计算挥发性风味化合物的保留指数（retentionindex，RI）。参考相关文献报道的RI值鉴定发酵乳样品中的挥发性风味物质。保留指数（RI）值代入公式（2）计算：

式中：RＴ——保留时间（min）；RＴ_（Z）、RＴ_（Z+1）和RＴ_（X）分别为正构烷烃碳原子数为Z、Z+1和待测物X的保留时间，且正构烷烃碳原子数的保留时间遵循RＴ_（Z）（X）（Z+1）的顺序原则。

将1，2-二氯苯溶液作为ISＴD加入发酵样品中，采用峰面积归一化法计算所有组分的相对峰面积比。样品中各组分风味物质的浓度代入公式（3）计算：

式中c_i—试验样品中各挥发性风味化合物的质量浓度，μg/L；cs—1，2-二氯苯的质量浓度，μg/L；A_i—样品中待测物质对应的色谱峰面积；As—ISＴD的色谱峰面积。
 

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