真菌Simplicilliumlanosoniveum色素的分离表征及培养基优化（一）

真菌色素是真菌天然色素的重要来源，具有独特的色素生产优势和生物活性，主要有红、分离黄、表征蓝三大色系。及培相对于红色色素，养基优化真菌黄色色素的真菌种类较少，但在食品、色素化妆品等方面具有广阔的分离市场前景。目前已发现产黄色色素的表征真菌主要有(1)红曲霉属(Monascusspp)产生萘醌类红曲黄色素，并已商业化生产；(2)曲霉属(Aspergillus)A．cristatus和A．xavus产生羟基蒽醌类黄色素；(3)青霉属Penicilliumcitreonigrum产生黄色素；(4)散囊菌属Eurotiumrubrum分泌蒽醌类棕黄色色素。及培而Simplicillium属真菌产生的养基优化色素则未见报道。

本实验室从蓝藻培养液中分离出一株共生真菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。真菌该真菌在沙氏培养基中合成一种新的色素抗生素、胞外多糖和微量的分离色素，而在含碳无机培养基中则大量合成黄色素(DT06色素)，这也是首次发现Simplicillium属的真菌能够合成色素。本文对DT06色素进行分离纯化、表征，研究其抗氧化性和稳定性，并采用Plackett—Burman和响应面设计，对其发酵培养基成分进行优化，为该色素的进一步应用奠定基础。

一、材料与方法

1、材料

（1）菌种与培养基

真菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工业大学代谢工程实验室分离，现保藏在中国科学院微生物研究所菌物标本馆，保藏编号HMAS242045。PDA培养基(1L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，pH自然。

改良BG-11培养基(1L)：NaNO₃0.76g，K₂HP0₄0.48g，MgS0₄·7H₂0O.075g，CaCl₂·2H₂00.036g，葡萄糖18g，Criticacidstock(CS)10mL，Tracemetalmix(TM)lmL，pH自然。

（2）材料、仪器与设备

2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：南京奥多福尼生物科技有限公司；其他分析纯化学品均购自天津大学科威公司。

Agilent-1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司；CARy300型紫外光谱分析仪：上海精科仪器厂；RE-5205旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

2、方法

（1）发酵方法

将4℃保藏的真菌DT06接种于PDA斜面培养基上，25℃培养5d，无菌条件下配制成孢子悬浮液，接种于100／250mLBG-11培养基中，在25℃、130r／min条件下摇床培养36h制成种子液，以l％的接种量把种子液转接到80／250mL改良BG-11培养基中，在相同条件下摇床培养7d。

（2）色素的分离与纯化

将发酵液在8000r／min条件下离心10min，除去菌丝体，收集上清液。500mL上清液中加入300mL盐酸酸化的乙酸乙酯，充分震荡，静置取上层乙酸乙酯萃取液。滤液低压蒸馏除去乙酸乙酯，得到的色素用甲醇溶解，再用0．22μm滤膜过滤，得到高纯度甲醇色素溶液。

（3）色素的色谱分析及含量计算方法

将得到的高纯度色素溶液用适量甲醇稀释，用紫外-可见分光光度计进行全波段扫描(200～800nm)，以确定最大吸收波长。

采用Agilent-1200高效液相色谱仪进行分析，色谱条件：C18(Kromasil)色谱柱(250mm×4．6mm，5μm)；进样量：20μL；柱温：25℃，紫外-可见光检测器。在上述条件下检测DT06色素的最佳流动相及流速。

在色素的最大吸收波长下，用吸光度值表示色素含量，色素含量表示为最大吸收波长下每毫升澄清发酵液的吸光度值。

（4）色素的抗氧化活性

分别测定真菌DT06色素对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羟基自由基的清除能力。DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的清除率计算公式为：[1-(A₁-A₂)／A₀]×100；羟基自由基清除率计算公式为：(A₁-A₀)／(A₂-A₀)×100，其中A₁、A₂和A₀分别为实验组、对照组和空白组的吸光值。相同条件下，用等浓度的维生素C做阳性对照。

（5）色素的稳定性

分别取一定量的色素溶液于具塞试管中，研究不同温度(4、20、40、60、80、100℃)、光照(黑暗、光照、紫外、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)对其稳定性的影响，每24h取样一次，用280nm处的吸光度值表示色素含量。

（6）培养基各组分的优化

在BG-11培养基的基础上，利用Plackett-Burman(PB)试验设计，研究葡萄糖(X₁)、NaN0₃(X₂)、K₂HP0₄(X₃)、MgS0₄·7H₂0(X₄)、CaCl₂‘2H₂0(X₅)、CS(X₆)、TM(X₇)对真菌DT06生产色素(Y)的影响，在PB实验设计结果的基础上，用Box-Behnken设计(BBD)进行响应面优化。

二、结果与讨论

1、色素的色谱分析

酸化的乙酸乙酯萃取液经减压蒸馏、甲醇复溶得到高纯度色素溶液，呈浅黄色(图1)。DT06色素能溶于水，不同于A．cristatus产的黄色素。色素甲醇溶液的紫外可见扫描光谱如图2a所示，在285nm处有特征吸收峰，与P．citreonigrum和E．rubrum黄色素分别在330nm和396nm处的特征吸收峰不同，285nm可以作为检测波长用于高效液相色谱分析和色素含量测定。
 

根据色素的极性和色谱柱的性质来选择合适的流动相和流速，最终确定当流动相为乙腈：水(2:8，V/V)、流速为0.8mL／min时色谱柱对色素的分离效果最好，如图2b所示，在10.52min左右出现单一峰(7.84min为甲醇溶剂峰)，峰形陡峭、对称性良好，表明色素纯度较高。

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