醇脱氢酶催化合成(S)

2.5 单水相催化体系的醇脱催化探索

据报道，反应体系中添加助溶剂可能影响产物的氢酶转化率和立体选择性。由于KpADH还原NBP0的合成e.e.值为97％，因此通过溶剂的醇脱催化优化可能提高终产物的立体选择性和反应转化率。作者针对单水相体系和水-有机两相体系进行了研究，氢酶根据不同底物浓度的合成研究结果，固定500mmol/L的醇脱催化底物浓度，保持底物与酶添加量的氢酶质量比(S/C)为18.2:l的条件下，选择不同的合成醇类助溶剂、有机溶剂以及绿色离子液体BMIN·PF6进行体系的醇脱催化优化。

如表2所示，氢酶反应体系2、合成3、醇脱催化4中分别加入体积分数5％醇类助溶剂，氢酶可以看出助溶剂虽然提高了反应的合成初速率，但是反应很快就在转化率为60％左右时终止，这是产物抑制导致的。反应5中加入5％的乙酸丁酯，最终转化率达到98.2％。由于乙酸丁酯的疏水性使得产物空间上与酶分离，因而转化率得以提升，但也限制了酶与剩余底物的充分接触，最终使得反应在24h的转化率未达到99％以上。少量有机溶剂的添加对e.e.值没有影响。综上，其中最佳的反应体系为不加任何助溶剂的磷酸盐缓冲液体系，在该体系中，反应转化率可以达到99％以上。

2.6 两相催化体系的探索

采用水-有机溶剂的两相体系可实现底物与酶、产物与酶在空间上的相对分离，从而避免酶失活。底物NBPO是疏水性底物，略微溶于水，不利于与酶分子充分接触。此外，底物对酶分子有一定毒性，这也会导致酶分子的失活，因此尝试两相反应体系实现油-水的界面反应。作者选取了具有不同1gP值的10种有机溶剂进行探究，分别测定了产物和底物在有机溶剂中的分配系数以及有机溶剂对KpADH催化活性的影响，结果见表3-4。最终选择产物分配系数分别为3.6和15.8以及残余活力分别为91％和5％的有机溶剂：甲苯和乙酸丁酯。反应体系6和7表明，50％有机溶剂的加入使e.e.值提高至98.9％。这表明酶在有机溶剂中刚性增强，构象更加稳定。但是，两相反应体系的转化率均没有达到99％的水平，且反应速率较慢，说明大量的底物溶解在有机溶剂中减少了酶与其碰撞的机会,所以反应速率下降，尤其是在反应后期底物较少的情况下，无法与酶充分接触，导致反应不完全。

2.7 克级制备(S)-NBHP

从上述反应体系优化的结果可知，未加入任何助溶剂的反应体系1可在24h内催化还原500mmol/LNBP0，达到99.6％的转化率，见图4。说明在该反应过程中，底物NBP0逐渐溶解并完全转化为产物(S)-NBHP，且产物难溶于水相体系，避免了与酶的大量接触，未对酶活产生显著影响。加入助溶剂后，反应初速度加快，但增加了产物的溶解度，使之达到抑制浓度(459.9±118.6)mmol/L，所以反应快速终止。另外，与两相体系相比，大量有机溶剂的加入可以略微提高产物的e.e.值，但转化不完全会影响终产物的纯度。所以，不加任何助溶剂的磷酸盐缓冲液体系更具备绿色、高效的生物催化制备条件。

因此。在反应体系1的基础上保持底物与酶添加量的质量比(S/C)为18.2g/g不变，逐渐增加底物的质量浓度至200g/L(1m01/L)，最终反应12h，可实现完全转化，产物的e.e.值为97％，产品收率为77％。与来源于酿酒酵母的羰基还原酶YDR541C催化合成(S)-NBHP相比，KpADH能够在不加任何有机溶剂和外源辅酶的条件下实现较高浓度的转化，表明脚ADH在酶法制备(S)-NBHP上具有良好的应用潜力。

3 结语

作者筛选和比较发现勋ADH可以高效还原NBPO合成(S)-NBHP。通过反应体系的探索，发现在加入乙醇等助溶剂的反应体系中有较强的抑制效应，且高浓度的产物NBHP对KpADH催化性能影响显著。通过动力学拟合，发现抑制类型为非竞争性抑制类型，并计算获得抑制常数Ki值为(459.92±118.59)mm01/L。反应体系优化的结果说明，不添加任何助溶剂的体系能够有效地避免产物抑制，同时也能使酶与底物充分接触，反应完全。在此基础上实现了200g/L底物的完全转化，克级制备获得了(S)-NBHP。作者初步探究了NBHP对醇脱氢酶的抑制机制，并优化和建立了解决抑制问题的反应体系，为实现(S)-NBHP的大规模酶法合成奠定了良好的研究基础。

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