栀子根结线虫病的病原鉴定（一）

植物寄生线虫是栀根制约全球粮食生产的重要因素之一。据统计，结线全世界因植物寄生线虫造成的虫病损失约800亿美元，其中根结线虫广泛分布于世界各地，病定是栀根危害极大的一类植物寄生线虫。目前根结线虫的结线防治措施包括种植抗病品种、使用化学杀线剂、虫病轮作、病定生物防治等，栀根其中线虫种类鉴定是结线各类防治措施实施的基础。

栀子又名黄栀子，虫病属茜草科栀子属植物，病定是栀根我国传统的中药材，不仅可以直接入药，结线其果实还是虫病提取食用色素添加剂“黄色素”的天然优质材料。栀子分布于广西、河南、浙江、江西、福建、湖北等地，种植栀子可促进产地农民增收，是目前广西贺州、柳州等地产业扶贫的有效途径。然而，栀子生产面临严重的病害问题，其中根结线虫病是其中一种重要的病害，在不同地区均有不同程度发生。熊英等、贾全全等、李冬等等相继在广西柳州、江西等地发现该病害，但多数研究集中于病害发生情况调查及药剂筛选方面，病原相关报道较少，仅有广西柳州、福建福鼎两地对其病原进行了鉴定。2018—2020年对广西贺州市的栀子种植基地进行调查，发现栀子受到根结线虫的危害，呈现植株长势差，叶片黄化、萎蔫、根系形成大量根结等症状，严重制约当地栀子种植产业的发展。本研究对采集到的栀子根系及其根际土壤进行分离，对分离得到的根结线虫二龄幼虫及雌虫进行形态观察及分子生物学鉴定，旨在明确栀子根结线虫病病原种类，为该病的有效治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试线虫的采集及分离

线虫样本采自贺州市八步区莲塘镇旗头岭文坡村、上寺村栀子种植基地，采用五点取样法挖取呈现根结线虫病症状的栀子根系及其根际土壤带回实验室。在解剖镜下，从根结挑取单卵块放置25℃恒温箱孵化成二龄幼虫，将二龄幼虫接种于预先培植于消毒土的栀子（贺栀1号）根部，进行活体保存，待用。试验时挖取根结线虫病症状明显的栀子根系及根际土壤，采用直接解剖法分离雌虫，将根系置于体视镜下用3号昆虫针挑取雌虫进行形态学观察；根际土壤采用改良贝曼漏斗法进行分离，25℃静置24h后，用小玻璃瓶收集约10mL线虫悬浮液。在体视镜下将根结线虫二龄幼虫从线虫悬浮液中挑出，经热杀死后制成临时玻片用于形态观察。

1.2 形态学鉴定

二龄幼虫及雌虫主要形态特征：使用尼康显微镜观察其头部、口针、尾部特征，并采用deMan公式对20条二龄幼虫进行测量，分别测量体长、最大体宽、口针长度、尾长、透明尾长和DGO（背食道腺开口至口针基部球的距离）等形态指标。

会阴花纹的制作及观察：参照张绍升的方法，从栀子根组织挑取成熟雌虫，放置滴有10μL40%乳酸的载玻片上，在体视显微镜下用手术刀切取虫体后部约1/4并将体内组织去除，用镊子将会阴花纹转移至滴有10μL纯甘油的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察拍照。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 线虫DNA提取

线虫DNA抽提采用单条线虫DNA提取法。参照王江岭等的方法略有改动，在经灭菌的凹面皿上滴入16μLddH2O和2μL10×PCRBuffer混合液，用挑虫针将单条根结线虫二龄幼虫挑入混合液中，取1号昆虫针将线虫切成2～3段，用移液器将含有线虫段的所有混合液转移至200μLPCR管中，加入2μL（1mg/mL）蛋白酶K，-80℃超低温冰箱放置20min，65℃温育60min，95℃加热10min，获得DNA提取液。DNA提取液可立即用于PCR扩增或放入–20℃冰箱保存备用。

1.3.2 PCR扩增

核糖体ITS区采用引物F194:5'-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3'和PXB481:5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'进行扩增，28SrDNAD2D3区采用通用引物D2A:5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3'和D3B:5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'进行扩增。PCR反应体系（50μL）：TaKaRaTaqHSPerfectMix(2×)25μL，上游引物（10μm）2μL，下游引物（10μm）2μL，模板DNA2μL，ddH2O19μL。扩增条件：94℃4min；94℃40s，55℃40s，72℃1min，共35个循环；最后725min。PCR产物进行1%Agarose胶电泳检测，PCR产物纯化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序。

1.3.3 序列分析

PCR产物测序结果用NTI11软件进行序列拼接，最终序列上传至GenBank，序列号分别为MH756121、MH756122、MN648519、MN648520。根据近年来发表的根结线虫系统进化文献，从GenBank下载相关线虫rDNA-ITS和28SrDNAD2D3序列，采用NTI11软件进行多重序列比对分析。

1.3.4 系统进化分析

采用MEGA7.0软件构建基于rDNA-ITS及28SrDNAD2D3区的Neighborjoing系统进化树。分别选择GenBank数据库中象耳豆根结线虫（M.enterolobii）rDNA-ITS序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969）和28SrDNAD2D3区序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969），南方根结线虫（M.incognita）rDNA-ITS序列（LC030363），花生根结线虫（M.arenaria）rDNA-ITS序列（KJ572384、AF387092）和28SrDNAD2D3区序列（AF435803、KJ598135），爪哇根结线虫（M.javanica）rDNA-ITS序列（AY438555、KX646187）和28SrDNAD2D3区序列（MT3412999、MN096736），巴拉那根结线虫（M.paranaensis）28SrDNAD2D3区序列（AF435800、KY911103），拟禾本科根结线虫（M.graminicola）28SrDNAD2D3区序列（MG273441、MG273443），分别以朱顶红短体线虫（Pratylenchushippeastri,FJ712935）和玻利维亚短体线虫（P.crenatus,MH973647）作为外类群，rDNA-ITS共计15条序列，28SrDNAD2D3区共计17条序列构建系统进化树，以自展法（bootstrap）进行1000次循环检测。

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