荧光光谱法和磷光光谱法（二）

总之，荧光荧光猝灭是光谱光谱由激发态分子与共存的其他化学物质之间的反应，或某种相互作用引起的法和法荧光强度降低的现象。利用激发态分子的磷光荧光猝灭可以对共存的痕量猝灭物质进行定量，甚至可以测定激发态分子的荧光反应速率常数。此外，光谱光谱荧光分析中常常使用荧光探针，法和法探针的磷光荧光最大发射波长及其强度或探针的荧光寿命对溶剂极性、pH值、荧光黏度等十分敏感，光谱光谱利用探针的法和法这些性质可以进行生物大分子、高分子材料等的磷光微环境分析。

荧光量子产率φ⁰_f的荧光定义是：

其测定方法是采用量子产率已知的硫酸奎宁、二萘嵌苯、光谱光谱9，法和法10-二苯基蒽等染料作为标准，在同一激发波长下同时测定参比物质和样品物质的荧光光谱、紫外可见吸收光谱，通过比较其积分荧光强度测定样品的荧光量子产率。计算公式为：

式中，Y_u和Y_s分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；F_u和F_s分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度；A_u和A_s分别表示待测物质和参比物质在该激发波长下的吸光度。

荧光量子产率与荧光寿命的关系如下：

式中，k_f，k_d，k_isc分别为荧光、内转换、系间窜跃过程的速率常数，三者之和的倒数即为荧光寿命τ。因此，只要测定荧光寿命，再通过式(15.4)求得荧光量子产率，就可以测定荧光速率常数忌，以及其他两项非辐射失活过程的速率常数之和(k_d+k_isc)。荧光量子产率、荧光寿命以及光致发光所涉及的各物理过程的速率常数反映了激发态的电子状态，是荧光分析中的重要参数。

三、仪器结构与原理

荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计类似，由光源、单色器、样品室、光电倍增管和计算机数据处理部分组成。不同的是，荧光分光光度计中的单色器包括激发单色器和发射单色器两个，并且为了避免激发光导致的瑞利散射的影响，一般激发光路和发射光路以荧光池为中心互成直角，光源多为氙灯光源。

图15.4和图15.5分别是荧光分光光度计组成和光路示意图。

由于荧光分析直接测定发光强度，荧光光谱的形状、强度等也包含了发射单色器、检测器响应等随波长变化等仪器因素的影响。一般获得的荧光光谱并非样品分子真实的光谱。在某一荧光发射波长下进行定量分析时一般影响不大，在测定荧光量子产率时，需要对仪器的波长响应特性进行校正。目前新出厂的部分荧光分光光度计已附有光谱校正的软件。如果仪器未白带光谱校正软件，需要使用已知真实荧光光谱的标准样品进行测定并加以校正。

用于荧光测定的样品池一般采用四面透明的石英池。如果激发波长在可见光区，特殊情况下也可以用简易的塑料管替代，但需要特别注意激发光散射的影响。此外，荧光测定多涉及痕量分析，常常检测微弱的荧光发射，需要注意溶剂中痕量的荧光杂质、溶解氧的影响。实验条件的选择以及试剂纯度等方面也需要注意。

参考资料：现代仪器分析实验与技术