R.oryzaeMG1发酵对姜油树脂抗氧化活性的影响（三）

4、酵对姜油R.oryraeMG1发酵姜油树脂条件的树脂响应面分析

（1）响应面模型建立及方差分析

依据单因素实验的结果，选择姜油树脂添加量、抗氧发酵温度和发酵时间用BBD程序设计三因素三水的化活平响应面优化方案，共17次试验，影响结果见表1。酵对姜油多元回归拟合得到的树脂二阶多项回归方程模型为：

Y=-4917.80206+50.60680X₁+248.91550X₂+462.95900X₃+0.077975X₁X₂+0.38

830X₁X₃-3.54325X₂X₃-0.37321X₁²-3.60654X₂²-44.66781X₃²，可表示经R.oryzaeMGI发酵后姜油树脂总抗氧化活性(Y)与姜油添加量(X₁)、抗氧发酵温度(X₂)、化活发酵时间(X₃)的影响联系。

方差分析见表2，酵对姜油回归效应显著(p＜0.05)，树脂说明方程模型置信度高于95%；失拟项不显著(p＞0.05)，抗氧说明方程模型自然误差不显著，化活拟合度好；复相关系数R²=0.9917，影响说明方程模型与实验数据的符合度可达99.17%；调整性决定系数AdjR²=0.9811，说明方程模型可信度高。基于上述分析，回归方程模型可以用来预测因素(X₁、X₂和X₃)与响应值(Y)的关系。

每个因素以及各因素互交作用对试验结果的线性效应的影响是否显著以p值表示，p值越小影响越显著(p＜0.05)。由表2可见，X₁、X₂对发酵后姜油树脂的TAC影响显著，X₃对发酵后姜油树脂的TAC影响不显著；X₁²、X₂²、X₃²对发酵后姜油树脂的TAC影响极显著；X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃互交对发酵后姜油树脂的TAC影响均不显著。由此可知，试验各因素对MG1发酵后姜油树脂的总抗氧化活性影响的显著程度为:姜油树脂添加量＞发酵温度＞发酵时间。

由图8可见，姜油树脂添加量与发酵时间、发酵温度与时间之间交互作用显著，姜油树脂添加量与发酵温度之间交互作用不显著，与响应面方差分析(表2)结果吻合。响应面3D模型见图8，随姜油树脂添加量增加，发酵后姜油树脂的TAC先增加后降低；随温度的升高，TAC同样先增加后降低；随发酵时间延长，TAC先缓慢增加，然后趋于平缓，与单因素试验结果相吻合。等高线的形状反映了各因素交互效应的强弱，椭圆形的离心率越接近1表示两因素交互作用越显著。由图8可见，姜油树脂添加量与发酵时间、姜油树脂添加量与发酵温度、发酵温度与时间之间交互作用均不显著，与响应面方差分析(表2)结果吻合。

经软件分析计，R.oryzae算MG1发酵姜油树脂的最佳模拟条件为:在20mLPDA液体培养基中添加姜油树脂73.47μL，33.25C震荡(150r/min)培养4.18d，在此条件下总抗氧化活性预测值可达2046.94umol/g。

（2）模型的验证

为了验证R.oryzaeMG1发酵姜油树脂抗氧化性能条件的可靠性，在模拟预测条件的基础上，根据实际情况，为方便控制实验操作条件以减少误差，最终确定的R.oryzaeMG1发酵姜油树脂条件为70μL的姜油树脂添加量，33℃下震荡(150r/min)培养4d。三次重复实验的总抗氧化活性平均为2025.44土5.01μmolg，实验值与理论预测值无显著性差异，拟合性较好，表明此模型是有效的，可用于预测MGI发酵姜油树脂的实际实验情况，具有一定的实践参考价值。在此条件下MG1发酵姜油树脂培养物的总抗氧化活性比对照组提高了69.15士1.01%，比优化前提高了7.17+0.91%，如图9所示。

5、姜油树脂活性成分高效液相色谱分析

发酵完成后，将培养基真空干燥后用甲醇超声萃取，取适量用0.22μm的尼龙膜过滤进样，进样体积10μL，检测波长280nm，流动相为乙腈和1%的冰醋酸，流速1.0mL/min，柱温48℃，运行时间62min，进行梯度洗脱。

积分结果如图10所示，姜油树脂中约有14种物质，经R.oryzaeMG1发酵后，以1号物质(6-姜酚)为参照，假设在其峰面积相等的情况下，2号物质(8-姜酚)的峰面积比发酵前减少了0.17倍，3号物质(6-姜烯酚)的峰面积比发酵前减少了0.37倍，4号物质(10-姜酚)的峰面积比发酵前减少了0.22倍，15号物质峰面积比发酵前减少了0.69倍；11、12、14号物质缺失；6号物质(10-姜烯酚)峰面积几乎不变；7号物质峰面积比发酵前提高了4.60倍，8号物质峰面积比发酵前提高了1.03倍，9号物质峰面积比发酵前提高了3.34倍、10号物质峰面积比发酵前提高了5.56倍，13号物质峰面积比发酵前提高了3.10倍；出现了5号(8-姜烯酚)16、17、18号物质。

说明经过R.oryzaeMG1的发酵，姜油树脂发酵提取物中的成分部分发生了转化，已知的五种物质相对含量降低，不仅使其他物质含量升高，还生成了新物质，总抗氧化活性较高随之提高。后续实验需进一步将新检测出的物质分离纯化，进行结构鉴定。

三、结论

本文通过对5株根霉发酵姜油树脂的抗氧化活性进行比较，R.oryzaeMG1表现出较强的发酵能力，抗氧化活性最高，且发酵液气味更清新，辛辣的气味减弱，有淡淡的柠檬香味。再以单因素及响应面方法优化得到了R.oryzaeMGI的最佳发酵条件，即在20mLPDA液体培养基中接种1%的MG1孢子悬液，姜油树脂添加量70uL，33℃下震荡(150r/min)培养4d，发酵后姜油树脂的抗氧化活性比发酵前提高了69.15士1.01%；经高效液相色谱分析，姜油树脂的R.oryzaeMG1发酵提取物中的成分发生了转化，且生成了4种新物质。由此可说明，R.oryzaeMG1的发酵对姜油树脂的抗氧化活性的提升及风味改善有一定的效果，可以据此研究开发高附加值的生姜风味发酵食品。

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