肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制 （三）

2结果与分析

2.1基因组DNA的肠道肠埃提取

利用NanoDrop2000对提取的CMCC44841基因组DNA进行了纯度测定，A260/280和A260/230分别为1.70和2.37。集聚菌菌利用qubit荧光计对提取的性大希氏EAECDNA测定了浓度为65ng/µL，提取的体和DNA能够满足后续全基因组测序和标准物质制备的实验要求。

2.2全基因组测序分析结果

本研究利用二代高通量全基因组测序技术对CMCC44841进行了序列测定。标准获得的物质基因组序列信息结果通过生物信息学分析，CMCC44841基因组大小为5.057285Mb，肠道肠埃其N50重叠大小为114319bp，集聚菌菌共121个长度从305600bp到505bp不等的性大希氏contigs，GC含量为50.6%，体和编码区基因5173个。标准利用CGE网站KmerFinder对细菌进行种属鉴定，物质结果显示CMCC44841鉴定为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），肠道肠埃具体鉴定结果如表2所示。集聚菌菌同时利用CGE网站进行血清预测、性大希氏多位点序列分型（MLST）和毒力基因分析，CMCC44841血清预测结果为O127：H21，MLST为ST40型，携带毒力基因除aggR、astA、pic之外，还预测到含有aap、aar、afaD、agg3C、lpfA、ompT等毒力基因，详见表3。CMCC44841全基因组测序数据已上传至NCBI数据库，序列号为SRR12278211。

2.3特征性基因PCR扩增结果

按照GB4789.6-2016的方法对CMCC44841分别进行了astA、aggR、pic特征性基因检测。PCR扩增结果显示提取的CMCC44841DNA分别扩增出102bp、400bp和1111bp长度片段。不同浓度DNA扩增结果如图1所示，0.1、0.01、0.001ng/µl的DNA均有特征性基因扩增产物，选择CMCC44841DNA冻干小球标准物质使用时PCR的模板量≥0.1ng/µl，按照20ng/球进行DNA标准物质的制备。

2.4标准物质的均匀性检验结果

随机抽取的20瓶EAEC菌体标准物质平板计数结果如表4所示。所有样品菌落数均在103CFU数量级，数值符合正态分布。SPSS软件单因子方差分析结果显示，F=1.59＜F临界值=2.137，P＞0.05。表明在显著水平为0.05时，本次所制备的EAEC菌体标准物质组内和组间无显著性差异，即样品符合均匀性要求。

随机抽取10瓶EAECgDNA标准物质，PCR产物电泳结果显示，10个gDNA标准物质的astA、aggR、pic基因均得到清晰的扩增条带（图2）。

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