不同洁净度葡萄的葡萄酒发酵效果研究（一）

采用1%盐水、不同1%淀粉液和自来水清洗赤霞珠葡萄，洁净酒发酵效究破碎后的度葡葡萄浆接种活化后的活性干酵母ST进行发酵，通过测定发酵过程中微生物菌群、葡萄还原糖、果研可溶性固形物、不同乙醇、洁净酒发酵效究乙酸及香气物质的度葡变化，考察不同洁净度葡萄的葡萄葡萄酒发酵效果。结果表明，果研1%盐水和1%淀粉清洗的不同葡萄原料在发酵过程中酵母菌生长旺盛、耗糖较快、洁净酒发酵效究乙醇和高级醇生成较多，度葡而细菌、葡萄霉菌生长和乙酸及酯类化合物生成较少。果研自来水及对照组(未清洗组)的酵母菌生长较少，耗糖较慢、乙醇和高级醇生成较少，而细菌和霉菌生长、乙酸和总酯生成较多。结果表明，用1%盐水或1%淀粉液清洗能去除较多的霉菌和细菌，提高酿酒葡萄洁净度，有利于葡萄酒发酵产乙醇及风味复杂性。

葡萄酒酿造使用的葡萄通常破碎后直接发酵，但在夏季高温多雨的葡萄种植区，葡萄容易爆发霜霉病、白粉病、炭疽病等病害，为了不影响葡萄的正常收获，果农们会喷洒杀虫剂、杀菌剂和除草剂等农药，导致葡萄皮上有一定的农药残留。研究发现，残留的农药会影响葡萄酒酿造过程中酵母的生长代谢，延迟发酵，产生一些不良代谢产物和异味物质，影响到葡萄酒的口感、香味等感官质量和食用的安全性。另外，葡萄皮上残留的有害微生物在葡萄发酵过程中与酿酒酵母菌群争夺养分，影响发酵并且会产生有害的副产物，比如醋酸菌可产生大量醋酸，引起葡萄酒的酸败味，霉菌可使果酒产生霉味等。减少葡萄皮上农药残留和有害微生物，对葡萄酒正常发酵、质量及饮用安全性将有一定积极作用。

通常葡萄酿酒不需要清洗原料，主要是利用葡萄表皮附着的微生物进行发酵。对于泥沙较多的葡萄原料在酿酒前需要对原料进行清洗沥干处理，但尚鲜见关于清洗葡萄的研究报道。本研究采用1%盐水、1%淀粉液和自来水对赤霞珠葡萄进行清洗，以不清洗的葡萄原料为对照，通过不同的清洗方法造成葡萄不同的洁净度，旨在研究不同洁净度葡萄发酵的效果，并监测不同清洗条件下发酵过程的菌群生长、还原糖消耗、可溶性固形物变化、乙醇含量、乙酸含量及香气物质含量变化等，考察不同洁净度葡萄对葡萄酒发酵效果的影响，为酿酒葡萄原料的状态控制提供理论依据，以保证正常良好的葡萄酒发酵过程和终产物葡萄酒质量。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料与菌株

赤霞珠葡萄：河北昌黎卢龙华夏基地中粮集团华夏葡萄酒公司；ST活性干酵母：辽宁本溪桓仁五女山米兰酒业有限公司。

1.1.2化学试剂

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术责任有限公司；氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸三铁、硫酸亚铁、硫酸锰、苯酚、3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylicacid，DNS）、葡萄糖（均为分析纯）：天津市天河化学试剂厂；玉米淀粉：南京甘汁园糖业有限公司；亚硫酸（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YEPD）培养基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，3.2×10⁴U/L青霉素和4×10⁴U/L的链霉素（用孔径为0.22μm的水系膜过滤除菌），调pH至6.0。

肉汤培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，纳他霉素25%，调pH至7.2～7.4。

察氏培养基：硝酸钠0.3%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸亚铁0.001%，氯化钾0.05%，蔗糖3%，琼脂2%，3.2万单位/L青霉素与4万单位/L的链霉素（用孔径为0.22μm的水系膜过滤除菌），调pH至6.7。

1.2仪器与设备

UV-5200型分光光度计：上海元析仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；H1750R离心机：湘仪离心机仪器有限公司；78-1磁力加热搅拌器：金坛市金城翔龙仪器厂；DNP-9082型恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；DW-86L-386立式超低温冰箱：青岛海尔特种电器有限公司；LERD-TECH高压蒸汽灭菌器、Memmert低温培养箱：北京五洲东方科技发展有限公司；Agilent7697A顶空进样器、AgilentGC6850气相色谱仪：美国安捷伦公司；KT-2000恒温摇床：常州市中贝仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1活性干酵母的活化及培养

将1gST活性干酵母溶于10mL无菌水，40℃恒温水浴培养15min，每5min轻微摇动一次，培养完成后得到一级活化液；随后将10mL稀释到20°Bx左右的模拟葡萄汁，加入到一级活化液中，25℃恒温水浴培养1h，每30min轻微摇动一次，培养完成后得到20mL二级活化液，取20mL的40°Bx左右的模拟葡萄汁，加入到二级活化液中，20℃恒温水浴培养2h，每30min轻微摇动一次。最后得到40mL0.25g/L的酵母种子液。

1.3.2葡萄原料的预处理

将1.8kg成串的赤霞珠葡萄分成3等份，分别浸没于4L的1%盐水、1%淀粉水及自来水中，在90r/min摇床清洗10min，捞出后，分别用4L自来水在90r/min的摇床清洗3次，每次清洗5min，自然晾干后将果粒剪下，手带一次性手套挤压2层纱布包裹的葡萄果粒，将破碎处理后的葡萄皮和葡萄汁液装入500mL三角瓶内，添加亚硫酸，使SO₂含量为60mg/L，每个处理3个平行。

1.3.3葡萄酒的制备

将上述清洗处理的葡萄的葡萄浆，接种活化的酵母液，使接入的酵母量为10²个/mL。接种后，混合均匀，瓶口安装发酵栓，以排放发酵产生的气体，在15～18℃静置发酵26d，以还原糖不再降低视为发酵结束。发酵过程中定期取样测定微生物菌群、理化指标及主要香气物质。

1.3.4取样及样品预处理

发酵过程中每3天取样一次，在取样前将带有发酵栓的玻璃锥形瓶以顺时针摇匀。将用于测定还原糖、可溶性固形物和挥发性物质的样品离心（4℃、8000r/min条件下离心5min）以除去菌群细胞，保存于-20℃冰箱中待测。

1.3.5分析检测

(1）菌群的测定

采用稀释涂平板法测定微生物菌群。将发酵液适当稀释后，分别在YEPD培养基、肉汤培养基和察氏培养基接种0.2mL于30℃静置培养至菌落不再增加为止，进行酵母菌、细菌和霉菌落计数。

(2）还原糖含量和可溶性固形物的测定

用DNS法测定还原糖含量。用手持糖量折光仪直接测定可溶性固形物含量。

(3）挥发性物质含量测定

乙醇、乙酸和香气成分含量都采用气相色谱测定。

样品前处理：依次将1.4gNaCl、磁力搅拌转子和7mL发酵上清液加入15mL顶空气相瓶中，用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）垫密封，放置在磁力搅拌器上，在250r/min下搅拌10min。

顶空进样条件：Agilent7697A顶空进样器；样品平衡温度90℃；样品平衡时间30min；进样口温度250℃；检测器温度250℃。

气相色谱条件：AgilentDB-FFAP毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；色谱柱初始温度40℃，稳定10min，以5℃/min升温至180℃，稳定1min，然后以20℃/min升温至230℃，稳定2min；空气流量300mL/min，氢气流量30mL/min，载气为氮气（N₂）流量10mL/min，分流比10∶1，进样量2μL。

1.3.6统计分析

所有实验均进行3次平行，数值表示为3次独立实验的“平均值±标准偏差”。使用IBMSPSSStatistics19.0软件进行显著性分析，然后以P<0.05的水平确定Duncan。

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