超声波对鸡骨蛋白酶解产物的影响及机理研究

鸡骨架是超声产物鸡肉类加工过程中的副产品，是波对所有畜禽骨肉中蛋白质含量最高的原料，蛋白质质量分数可达16.3%，鸡骨机理与等量鸡胸肉相似。蛋白的影鲜鸡骨架质量占整鸡质量的酶解比例约为20%~22%，大致由71%的响及鸡骨，22%的研究鸡骨肉及6%的鸡皮构成。新鲜鸡骨中含有丰富的超声产物营养素，尤其是波对蛋白质和矿物质，此外鲜骨内含有大量骨髓，鸡骨机理主要由水分，蛋白的影粗蛋白质、酶解粗脂肪和微量元素等物质构成"。响及目前，研究工业生产上对鸡骨架的超声产物利用还存在利用途径少、产品价值低等问题，其主要经过粉碎烘干后作为宠物饲料.甚至直接丢弃。

随着科学技术的进步，食晶加工、设备制造等技术的发展给骨类食品的产业化发展带来了新的机遇，鲜骨加工产业的原料利用率和产品附加值有所提高，研究表明，骨蛋白酶解后释放的氨基酸及多肽具有如下特点：加工性能提高，表现在酶解产物的溶解性、吸水性、保水性、乳化性.起泡性及持油性等方面鬥；功能性显著，胶原多肽具有降血压气抗氧化”、促进皮肤胶原代谢等生物活性与功能"；风味增强，骨蛋白经酶解后，具有肉的特殊鲜味与香味，可作为肉味香精的前体，通过后期的美拉德反应可制备出各种风味的香精调味料9。因此，探究鸡骨架的深加工技术和应用，提高其产品附加值，对于充分利用低值蛋白资源具有重要意义。

近年来，有不少研究探讨和报道了低值畜骨的综合利用，其主要是利用蛋白酶酶解低值蛋白，实现低值蛋白源的高值化。为了提高其酶解速率，一些研究者探索将部分新技术引人其中。超声波属于-种弹性机械波叫，其频率范围在2x10*-2x10*Hz之间，在介质中传播时，可能产生热效应、机械效应和空化效应等，其中空化作用被认为是影响超声波在液体介质中反应速度和产率的主要原因。空化作用可引起多种次级效应，如湍动效应、微扰效应、聚能效应等"，这些效应能够改变蛋白质的构象和特性，强化提取过程、加速反应进程。超声波在反应过程中产生的气泡经过挤压破裂，能在瞬间产生较强的机械剪切力，对液体介质中的大分子产生机械性断键作用，从而促使更多亲水基团的暴露，有利于底物与酶的结合，提高蛋白质的水解程度0214。

作者以鸡骨架为原料，采用Alealase碱性蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶水解鸡骨蛋白，以水解度、多肽含量等作为测试指标，研究超声波处理应用于双酶分步酶解鸡骨蛋白.探讨不同超声条件对鸡骨蛋白的酶解效果的影响，并针对其结果进行机理初探。

材料与方法

1.1材料与试剂.

原料：鸡骨架，超市购买，冷冻贮藏保存备用。Alealse蛋白酶，Flavourzyme蛋白酶；诺维信公司产品；甲醛溶液、三氯乙酸、氢氧化钠、硫酸铜、牛白蛋白、溴化钾等试剂均购置于国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

2-16PK型高速冷冻离心机：Sigma公司产品：JY98--3D超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司产品：UV2600型紫外分光光度计：Techomap公司产品；FA1004型电子分析天平：上海舜宁恒科学仪器有限公司产品；实验室pH计Starter3100：奧豪斯仪器(上海)有限公司产品；8S-1型磁，力搅拌器：江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂产品：SSW-420-2S型电热恒温水槽：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；真空冷冻干燥机：作者所在实验室设计组装。

1.3试验方法

1.3.1鸡骨蛋白酶解液的制备方法

将鸡骨架解冻后清洗除去多余的血渍，去除鸡皮及油脂，用粉碎机粉碎成鸡骨泥，将鸡骨泥与去离子水以1：2的质量比混合，充分搅拌后，经过110ºC30min高温高压预处理，调节温度和pH值，酶解总时间为3h，酶解完毕后沸水浴灭酶10min，4500r/min下离心15min，过滤除去悬浮物与碎骨渣，即得酶解液。薛解过程中采用超声波铺助酶解的处理方式，即酶解：鸡骨蛋白的同时进行超声处理.超声功率分别为200.400.600，800.1000W，超声工作时间/间歇时间2s/2s，超声总时间分别设置为20.40.60、80min。双酶分步酶解的具体操作过程为：先用NaOH溶液和稀盐酸调节鸡骨泥匀浆的pH，首先调节pH值至8.5，向其中添加质量分数为0.2%的碱性蛋白酶，搅匀，55ºC下恒温酶解1.5h后；再将pH值调节至7.向其中添加质量分数为0.2%的风味蛋白酶，搅匀，50ºC下恒温酶解1.5h，制得酶解液。

1.3.2水解度的测定

采用中性甲醛滴定法，即甲醛滴定出氨基氮质量分数(具体参见国标GB/T5009.39--2003中所述方法)，凯氏定氮法测定出总氮质量分数(具体参见国标CB5009.5--2010中所述方法)，两者的百分比记为水解度。

1.3.3多肽质量浓度的测定

采用双缩脉法测定多肽含量，以牛白蛋白(BSA)作为标样，分别配置成0.5.1.2.3.4mg/mL的溶液，取2mLBSA溶液与3mL双縮脲试剂均匀混合，静置30min后，于540nm下，测定标样的吸光度值，并绘制标准曲线。样品中多肽质量浓度测定时，取2mL的多肽酶解液，加人等体积的体积分数10%三氣乙酸，均匀混合后于4ºC、4000r/min高速冷冻离心20min得到上清液，取上清液，按照标准曲线测定方法，测定出相应的吸光度值，按以下公式计算多肽质量浓度

1.3.4电子舌分析

取酶解液70ml，分别倒入电子舌专用测试杯中，使液面低于刻度线0.5-1.0mm，机器自动测试4次，分析时取后3组实验的平均值，并转化为各味觉的响应值数值再输出。响应值差异越大表明差异越大，正值表明该味觉比对照组强，负值则相反。1.3.5.氨基酸组成测定用10g/dL.三氯乙酸等体积稀释，放置1h，保证溶液体系中TCA终质量分数为5%。双层德纸过滤后，取1mL澄清滤液于15mL.离心管内，10000r/min下离心15min，后取400μL上清液于液相样品瓶内，置于氨基酸分析仪上测定。1.3.6傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析采用溴化钾(KBr)压片法制片后置于配有DTCS检测器的IS10型傳里叶红外光谱仪上进行检测。将酶解液冻干后磨粉，再放人玛瑙研钵中磨为细粉，加入适量的KBr搅磨均匀，然后压片待测。

2结果与分析

2.1超声作用对酶解产物水解度及多肽含量的影响

由图2可知，随着超声功率的增加，鸡骨蛋白酶解液的DH及其多肽含量均呈现先上升后下降的变化趋势。超声波功率为200-600W时，鸡骨蛋白的DH有显著提高(P<0.05)，且在600W时达到最大值，为1799%，当超声波功率超过600W时，鸡骨蛋白的DH开始下降，1000W时下降至14.13%；而超声功率为200-800W时，鸡骨蛋白酣辉液的多肽质量浓度呈上升趋势，且在800w时达到最大值291mg/mL，1000w时酶解液的多肽质量浓度下降至.2.73mg/ml。这可能是因为，鸡骨蛋白的空间结构在适当功率的超声波作用下会发生改变，蛋白质内部的活性部位暴露出来，与酶更好的结合，此外，超声波的振荡作用可以使酶与底物的碰撞几率增大，促进二者的结合.从而提高酶解产物的DH。但当超声波功率过大时，蛋白分子的活性部位、蛋白酶的分子构象均会被损伤，导致酶解产物DH的下降"。

图3表示的是超声处理时间对鸡骨蛋白酶解产物特性的影响。随着超声时间的延长，鸡骨蛋白酶解液的DH及多肽含量同样呈现先上升后下降的变化趋势.这与超声功率所述规律一致。当超声时间为30min时，DH达到24%，多肽质量浓度达到2.14mg/mlL，此后，延长时间DH及多肽质量浓度反而下降。这可能是因为超声时间适宜时，超声改变了蛋白质结构，加大了酶与底物的结合速率和产物的释放速率吗，从而促进了酶解过程的进行。然面随着超声时间的延长。超声的空化作用和扰动作用有可能使已游离的蛋白质分子重新聚合，形成大分子物质，底物分子构象的改变进而使其对酶解的促进作用减弱。

声明：本文所用图片、文字来源《食品与生物技术学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：蛋白酶，三氯乙酸，硫酸铜